日期:2026-05-16 21:56:50

本抗体为艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源多克隆抗体(货号:A301-231A),特异性识别DNA聚合酶η(PolH)蛋白的C末端区域(第663位至C末端,精细表位位于690–713位)。经抗原亲和纯化,提供完整IgG分子形式,未偶联任何标记物(Unconjugated)第一配资网,浓度为200 µg/mL。适用于免疫沉淀(IP)和蛋白质印迹(WB),反应种属为人。
理化参数
参数项目 详细规格
目标抗原 PolH(DNA聚合酶η)
反应种属 人
宿主来源 兔
克隆类型 多克隆
抗体形式 完整IgG
免疫原 第663位至C末端之间的区域
精细表位 第690–713位氨基酸
亚型 IgG
偶联物 无
纯度 抗原亲和纯化
抗原物种 人
浓度 200 µg/mL
保存条件 2–8 °C
有效期限 自收货起1年
缓冲体系 Tris缓冲盐水,含0.1% BSA和0.09%叠氮化钠
浓度测定依据:采用比尔定律(Beer’s Law),标准为1 mg/mL IgG在280 nm波长处的吸光值(A280)为1.4。
别名:RAD30、RAD30A、XPV、XP-V、色素性干皮病变异型蛋白。
生产与纯化流程
1. 免疫原设计:选择人PolH蛋白C末端第663位至C末端(含690–713位精细表位)的合成肽段
2. 免疫方案:免疫兔,诱导产生多克隆抗血清
3. 亲和纯化:将表位特异性肽段固定在固相支持物上,从抗血清中亲和捕获特异性抗体,去除与其他DNA聚合酶(如Polι、Polκ)的交叉反应
4. 浓度标定:A280法,1 mg/mL对应吸光值1.4
5. 缓冲体系:Tris缓冲盐水(TBS)含0.1% BSA作为稳定蛋白,0.09%叠氮化钠作为防腐剂
注:本品浓度较低(200 µg/mL),但经亲和纯化后特异性高,推荐稀释倍数在WB中可达1:2,000–1:10,000,IP中需按体积计算用量(30 µL/mg裂解液)。
适用范围与推荐使用条件
> 重要说明:本抗体经验证适用于免疫沉淀(IP)和Western blot(WB)。所有WB实验采用统一封闭和稀释条件(5%牛奶-TBST,一抗过夜)。
应用技术 推荐使用条件 备注
免疫沉淀(IP) 6 µg抗体/毫克裂解液 按总蛋白质量计算抗体用量
蛋白质印迹(WB) 1:2,000 – 1:10,000 推荐起始稀释度1:5,000
浓度换算:本品浓度为200 µg/mL,即0.2 µg/µL。进行IP时,如需6 µg抗体/毫克裂解液,则需加入30 µL抗体原液/毫克裂解液。
Western blot 详细操作指南
以下操作参数已由生产实验室验证并推荐。
标准WB流程(细胞裂解液)
样本制备:
PolH在多种细胞系中表达水平中等偏低(相对于管家蛋白),建议使用含蛋白酶抑制剂的RIPA或NP-40裂解液提取总蛋白
蛋白浓度定量后,加入SDS上样缓冲液(含DTT或β-巯基乙醇),95°C煮沸5–10分钟
注意:PolH表达具有细胞周期依赖性(在S期较高),且受DNA损伤诱导(如紫外线处理)。推荐使用UV处理(10–20 J/m²,6–12小时恢复)或使用已知高表达PolH的细胞系以增强信号
凝胶电泳:
PolH分子量约78 kDa(实际预测78.3 kDa)
推荐使用8–10% SDS-PAGE分离胶,可清晰分离PolH条带
上样量:细胞裂解液建议40–60 µg总蛋白/泳道(因表达水平较低,可能需要较大上样量)
转膜:
PVDF膜(需甲醇活化)或硝酸纤维素膜
湿转条件:恒流250–300 mA,冰浴转膜90分钟;或4°C过夜转膜(25–30 V)
转膜后可用丽春红染色确认转膜效率
封闭(生产实验室参数):
封闭液:5% 脱脂牛奶-TBST
封闭条件:室温摇床1小时
一抗孵育(生产实验室参数):
稀释液:5% 脱脂牛奶-TBST
稀释度:1:2,000 – 1:10,000(推荐起始1:5,000;若信号弱可降至1:2,000)
孵育条件:4°C过夜(强烈推荐,低丰度蛋白需延长孵育时间)
洗涤:
TBST洗涤3次,每次10分钟
二抗孵育:
二抗:山羊抗兔IgG(重链+轻链)HRP偶联抗体,货号 A120-101P(或其他等效产品)
稀释度:按厂商推荐(通常1:5,000–1:20,000),使用5%牛奶-TBST稀释
孵育条件:室温1小时
洗涤:TBST洗涤3–5次,每次10分钟
检测:
化学发光法(ECL),建议使用高灵敏度ECL底物(如SuperSignal West Femto、Pierce ECL Plus),因PolH表达丰度较低,常规ECL可能信号不足
曝光时间:初次尝试可曝光30秒、1分钟、5分钟,根据信号强度调整
免疫沉淀后Western blot的特殊要求
当本抗体用于免疫沉淀实验,随后对免疫沉淀复合物进行Western blot检测时,洗脱产物中包含用于IP的抗体(兔IgG)的重链(约55 kDa)和轻链(约25 kDa)。PolH分子量约78 kDa,介于重链(55 kDa)和轻链(25 kDa)之间,但重链55 kDa与PolH 78 kDa有一定距离,通常常规IP-WB使用抗兔H+L二抗产生的重链信号不会直接覆盖PolH条带。然而,如果检测PolH的修饰形式或互作蛋白分子量接近55 kDa,则可能产生干扰。
优化方案(生产实验室推荐,尤其适用于多重检测或高灵敏度需求):
1. 二抗选择:使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体(仅识别兔IgG轻链,不识别重链)
2. 封闭缓冲液补充:在封闭液中加入5% 正常猪血清(货号 S100-020)
操作步骤(IP-WB):
完成免疫沉淀后,将洗脱样本煮沸变性,进行SDS-PAGE(8–10%凝胶)
转膜后,封闭液使用含5%正常猪血清的5%牛奶-TBST
一抗孵育:本抗体(1:5,000),用含5%正常猪血清的封闭液稀释,4°C过夜
二抗孵育:抗兔IgG轻链HRP抗体(1:5,000–1:10,000),室温1小时
检测:高灵敏度ECL
储存与稳定性
储存条件:
温度:2–8°C(严禁冷冻,冷冻会导致抗体蛋白变性及活性丧失)
防腐剂:0.09%叠氮化钠
稳定蛋白:0.1% BSA防止低浓度抗体吸附损失
分装建议:本品浓度较低,建议避免频繁开盖,可分装为25–50 µL/管,仍储存于2–8°C(不建议-20°C)
有效期:自收货之日起12个月。
失效迹象:
出现明显沉淀(BSA可能形成微量沉淀,离心后测试;大量沉淀则废弃)
阳性对照样本(UV处理的HeLa裂解液)WB信号显著下降或消失
IP-WB背景异常升高第一配资网
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