日期：2026-05-16 21:56:50
本抗体为艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源多克隆抗体（货号：A301-231A），特异性识别DNA聚合酶η（PolH）蛋白的C末端区域（第663位至C末端，精细表位位于690–713位）。经抗原亲和纯化，提供完整IgG分子形式，未偶联任何标记物（Unconjugated）第一配资网，浓度为200 µg/mL。适用于免疫沉淀（IP）和蛋白质印迹（WB），反应种属为人。
理化参数
参数项目 详细规格
目标抗原 PolH（DNA聚合酶η）
反应种属 人
宿主来源 兔
克隆类型 多克隆
抗体形式 完整IgG
免疫原 第663位至C末端之间的区域
精细表位 第690–713位氨基酸
亚型 IgG
偶联物 无
纯度 抗原亲和纯化
抗原物种 人
浓度 200 µg/mL
保存条件 2–8 °C
有效期限 自收货起1年
缓冲体系 Tris缓冲盐水，含0.1% BSA和0.09%叠氮化钠
浓度测定依据：采用比尔定律（Beer’s Law），标准为1 mg/mL IgG在280 nm波长处的吸光值（A280）为1.4。
别名：RAD30、RAD30A、XPV、XP-V、色素性干皮病变异型蛋白。
生产与纯化流程
1. 免疫原设计：选择人PolH蛋白C末端第663位至C末端（含690–713位精细表位）的合成肽段
2. 免疫方案：免疫兔，诱导产生多克隆抗血清
3. 亲和纯化：将表位特异性肽段固定在固相支持物上，从抗血清中亲和捕获特异性抗体，去除与其他DNA聚合酶（如Polι、Polκ）的交叉反应
4. 浓度标定：A280法，1 mg/mL对应吸光值1.4
5. 缓冲体系：Tris缓冲盐水（TBS）含0.1% BSA作为稳定蛋白，0.09%叠氮化钠作为防腐剂
注：本品浓度较低（200 µg/mL），但经亲和纯化后特异性高，推荐稀释倍数在WB中可达1:2,000–1:10,000，IP中需按体积计算用量（30 µL/mg裂解液）。
适用范围与推荐使用条件
> 重要说明：本抗体经验证适用于免疫沉淀（IP）和Western blot（WB）。所有WB实验采用统一封闭和稀释条件（5%牛奶-TBST，一抗过夜）。
应用技术 推荐使用条件 备注
免疫沉淀（IP） 6 µg抗体/毫克裂解液 按总蛋白质量计算抗体用量
蛋白质印迹（WB） 1:2,000 – 1:10,000 推荐起始稀释度1:5,000
浓度换算：本品浓度为200 µg/mL，即0.2 µg/µL。进行IP时，如需6 µg抗体/毫克裂解液，则需加入30 µL抗体原液/毫克裂解液。
Western blot 详细操作指南
以下操作参数已由生产实验室验证并推荐。
标准WB流程（细胞裂解液）
样本制备：
PolH在多种细胞系中表达水平中等偏低（相对于管家蛋白），建议使用含蛋白酶抑制剂的RIPA或NP-40裂解液提取总蛋白
蛋白浓度定量后，加入SDS上样缓冲液（含DTT或β-巯基乙醇），95°C煮沸5–10分钟
注意：PolH表达具有细胞周期依赖性（在S期较高），且受DNA损伤诱导（如紫外线处理）。推荐使用UV处理（10–20 J/m²，6–12小时恢复）或使用已知高表达PolH的细胞系以增强信号
凝胶电泳：
PolH分子量约78 kDa（实际预测78.3 kDa）
推荐使用8–10% SDS-PAGE分离胶，可清晰分离PolH条带
上样量：细胞裂解液建议40–60 µg总蛋白/泳道（因表达水平较低，可能需要较大上样量）
转膜：
PVDF膜（需甲醇活化）或硝酸纤维素膜
湿转条件：恒流250–300 mA，冰浴转膜90分钟；或4°C过夜转膜（25–30 V）
转膜后可用丽春红染色确认转膜效率
封闭（生产实验室参数）：
封闭液：5% 脱脂牛奶-TBST
封闭条件：室温摇床1小时
一抗孵育（生产实验室参数）：
稀释液：5% 脱脂牛奶-TBST
稀释度：1:2,000 – 1:10,000（推荐起始1:5,000；若信号弱可降至1:2,000）
孵育条件：4°C过夜（强烈推荐，低丰度蛋白需延长孵育时间）
洗涤：
TBST洗涤3次，每次10分钟
二抗孵育：
二抗：山羊抗兔IgG（重链+轻链）HRP偶联抗体，货号 A120-101P（或其他等效产品）
稀释度：按厂商推荐（通常1:5,000–1:20,000），使用5%牛奶-TBST稀释
孵育条件：室温1小时
洗涤：TBST洗涤3–5次，每次10分钟
检测：
化学发光法（ECL），建议使用高灵敏度ECL底物（如SuperSignal West Femto、Pierce ECL Plus），因PolH表达丰度较低，常规ECL可能信号不足
曝光时间：初次尝试可曝光30秒、1分钟、5分钟，根据信号强度调整
免疫沉淀后Western blot的特殊要求
当本抗体用于免疫沉淀实验，随后对免疫沉淀复合物进行Western blot检测时，洗脱产物中包含用于IP的抗体（兔IgG）的重链（约55 kDa）和轻链（约25 kDa）。PolH分子量约78 kDa，介于重链（55 kDa）和轻链（25 kDa）之间，但重链55 kDa与PolH 78 kDa有一定距离，通常常规IP-WB使用抗兔H+L二抗产生的重链信号不会直接覆盖PolH条带。然而，如果检测PolH的修饰形式或互作蛋白分子量接近55 kDa，则可能产生干扰。
优化方案（生产实验室推荐，尤其适用于多重检测或高灵敏度需求）：
1. 二抗选择：使用抗兔IgG轻链HRP偶联抗体（仅识别兔IgG轻链，不识别重链）
2. 封闭缓冲液补充：在封闭液中加入5% 正常猪血清（货号 S100-020）
操作步骤（IP-WB）：
完成免疫沉淀后，将洗脱样本煮沸变性，进行SDS-PAGE（8–10%凝胶）
转膜后，封闭液使用含5%正常猪血清的5%牛奶-TBST
一抗孵育：本抗体（1:5,000），用含5%正常猪血清的封闭液稀释，4°C过夜
二抗孵育：抗兔IgG轻链HRP抗体（1:5,000–1:10,000），室温1小时
检测：高灵敏度ECL
储存与稳定性
储存条件：
温度：2–8°C（严禁冷冻，冷冻会导致抗体蛋白变性及活性丧失）
防腐剂：0.09%叠氮化钠
稳定蛋白：0.1% BSA防止低浓度抗体吸附损失
分装建议：本品浓度较低，建议避免频繁开盖，可分装为25–50 µL/管，仍储存于2–8°C（不建议-20°C）
有效期：自收货之日起12个月。
失效迹象：
出现明显沉淀（BSA可能形成微量沉淀，离心后测试；大量沉淀则废弃）
阳性对照样本（UV处理的HeLa裂解液）WB信号显著下降或消失
IP-WB背景异常升高第一配资网
京海策略提示：文章来自网络，不代表本站观点。
- 上一篇：配资炒股平台入配资 古人讲：男看鼻子女看嘴，一生富贵少是非，祖宗的经验之谈
- 下一篇：没有了
相关文章
沪深京指数
热点资讯
